避免抗體實(shí)驗(yàn)誤差解析五大常見(jiàn)問(wèn)題有哪些

一、抗體選擇與驗(yàn)證問(wèn)題

?特異性不足?：需明確目標(biāo)蛋白的亞型、修飾狀態(tài)及識(shí)別表位，優(yōu)先選擇經(jīng)過(guò)WB驗(yàn)證的抗體（如CST、Abcam等品牌），并查閱獨(dú)立文獻(xiàn)驗(yàn)證。

?種屬匹配錯(cuò)誤?：確保抗體說(shuō)明書(shū)標(biāo)注的種屬反應(yīng)性與實(shí)驗(yàn)樣本一致（如人、小鼠等）。

二、樣本處理與保存問(wèn)題

?樣本降解?：組織樣本需及時(shí)固定（離體2小時(shí)內(nèi)），裂解液需含蛋白酶/磷酸酶抑制劑，避免反復(fù)凍融。

?定量偏差?：采用BCA法或Bradford法時(shí)需注意去污劑干擾，建議分裝保存以減少凍融影響。

三、實(shí)驗(yàn)操作優(yōu)化

?抗體濃度與孵育?：避免盲目提高濃度，需通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化稀釋比例（如WB常用1:1000），4℃過(guò)夜孵育可增強(qiáng)特異性結(jié)合。

?封閉不充分?：更換封閉液品牌（如BSA或脫脂牛奶）或延長(zhǎng)封閉時(shí)間，降低非特異性結(jié)合。

四、信號(hào)檢測(cè)與背景控制

?高背景?：檢查二抗?jié)舛仁欠襁^(guò)高，優(yōu)化洗滌條件（如增加洗滌次數(shù)或調(diào)整沖擊力）。

?條帶模糊/缺失?：驗(yàn)證轉(zhuǎn)膜條件（電流、時(shí)間）及抗體效價(jià)，使用陽(yáng)性對(duì)照確認(rèn)蛋白表達(dá)。

五、抗體保存與使用誤區(qū)

?反復(fù)凍融?：分裝保存（建議≥10μL/管），避免效價(jià)降低；即用型抗體需4℃保存，長(zhǎng)期不用建議-80℃。

?回收利用風(fēng)險(xiǎn)?：稀釋后抗體緩沖體系易變化，推薦現(xiàn)配現(xiàn)用，尤其對(duì)效價(jià)敏感的抗體。

通過(guò)嚴(yán)格遵循上述步驟，可顯著降低抗體實(shí)驗(yàn)誤差，提高結(jié)果可靠性。